dTTP常用于PCR、real-time PCR、RT-PCR、cDNA合成、引物延伸反應(yīng)、DNA測序、DNA標(biāo)記等各種常規(guī)分子生物學(xué)反應(yīng)。
本產(chǎn)品為溶液鈉鹽形式，用超純水配制，并用高純度NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，濃度為100 mM。
經(jīng)檢測，dGTP純度≥99%（HPLC），且無DNase和RNase污染。
本產(chǎn)品為即用型，可以直接用于PCR等各種常規(guī)分子生物學(xué)反應(yīng)。
特點(diǎn)包括：
• pH 7.5
• HPLC 確認(rèn)純度 >99%
• 在 –20°C 下穩(wěn)定保存 2 年
• 不含 qPCR、PCR、逆轉(zhuǎn)錄抑制劑
• 不含 DNase 和 RNase
• 不含人類和大腸桿 DNA
PCR 反應(yīng) 概要:
1.配置反應(yīng)體系
將各成分依次加入到 0.5ml 的離心管中
擴(kuò)增使用熱啟動(dòng)酶，可在常溫下操作，非熱啟動(dòng)型的酶要在低溫配置反應(yīng)體系。
2.按照試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)時(shí)間和溫度，擴(kuò)增結(jié)束后電泳鑒定
3.瓊脂糖核酸電泳:
· 將電泳所用器具蒸餾水洗凈，架好梳子
· 根據(jù)要分離的 DNA 片段大小制備合適濃度的瓊脂糖凝膠，準(zhǔn)確稱取一定的瓊脂糖加入到錐形瓶中，加入 30ml 左右的電泳緩沖液（TAE 或 TBE）
· 在微波爐中加熱融化后冷卻至 40℃左右，充分混勻后倒入電泳槽中
· 室溫下凝固 40 分鐘左右，小心拔出梳子，將凝膠放置電泳槽中準(zhǔn)備點(diǎn)樣
· 在電泳槽中加入電泳緩沖液，漫過凝膠表面即可，點(diǎn)樣孔內(nèi)不要有氣泡
· 樣品點(diǎn)樣前準(zhǔn)備好，（在八連管中）加入 5ul 樣品，1ul 的 6xLoding buffer 和 1ul 的染料混合，用搶將混合后的樣品緩緩注入到點(diǎn)樣孔中，注意不要串孔
· 按照正負(fù)極（紅正黑負(fù)），接通電源，電壓 40-60V，時(shí)間 30-40min，可根據(jù)溴酚藍(lán)的位置判斷是否終止電泳
· 電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，凝膠成像觀察，并對比 marker 確定片段大小
(不同的瓊脂糖濃度分離不同大小的 DNA 片段)
注意事項(xiàng):
引物
引物是決定 PCR 反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，要保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確、高效，引物的設(shè)計(jì)要遵循如下原則：
1. 引物的設(shè)計(jì)在 cDNA 的保守區(qū)域，在 NCBI 上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析的軟件，得到不同基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)
2. 引物的長度：15-28bp，長度大于 38bp，會(huì)使退火溫度升高，不利于普通 Taq 酶的擴(kuò)增
3. 引物 GC 含量在 40%-60%，Tm 值最好接近 72℃
4. 因密碼子的簡并性，引物的 3’端最好避開密碼子的第三位（最好為 T）
5. 堿基分布錯(cuò)落有致，3’端不超過 3 個(gè)連續(xù) G 或 C
6. 引物自身不要形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物設(shè)計(jì)完成，要 BLAST 驗(yàn)證
模板
PCR 擴(kuò)增對模板的要求不高，單鏈、雙鏈 DNA 均可作為擴(kuò)增片段，雖然 PCR 能夠擴(kuò)增微量的 DNA，為了保證擴(kuò)增的特異性，對不同來源的模板，起始濃度有一定要求，可以是純化后的樣品也可以是粗制品，不同來源的模板采取不同的處理方法，實(shí)驗(yàn)?zāi)０宓募兓胶唵卧胶茫０逯腥绻腥魏蔚?Taq 酶抑制劑、蛋白酶、核酸酶等，會(huì)干擾反應(yīng)。模板提取注意保存，不能放置太久，避免反復(fù)凍融并防止降解。多數(shù)人會(huì)忽略這一問題，當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有任何條帶時(shí)，可優(yōu)先考慮是否為模板降解的原因。
其他
1. Taq DNA 聚合酶：Taq 酶種類有很多，熱啟動(dòng)酶，高保真酶，根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用選擇合適的酶擴(kuò)增，一般的反應(yīng)，化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)酶即能很好的完成，化學(xué)修飾熱啟動(dòng)酶能夠 避免低溫下任何非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生。酶的濃度對擴(kuò)增有一定影響，酶用量過多，會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物，操作按照說明書即可。
2. dNTP：四種 dNTP 的濃度要相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會(huì)引發(fā)堿基的錯(cuò)誤滲入。此外，dNTP能夠和體系中鎂離子結(jié)合，從而影響體系中鎂離子的濃度。
3. 緩沖液：緩沖液一般隨酶提供，一般的 PCR 試劑盒包括 Taq 酶，緩沖液，dNTP，水。初次擴(kuò)增，可以完全按照試劑盒的說明書操作，如果擴(kuò)增結(jié)果有問題，可自己嘗試摸索實(shí)驗(yàn) 條件或重新設(shè)計(jì)引物提取模板擴(kuò)增。
4. 因空氣中和手上有一定污染源，操作過程中要戴手套，在干凈的環(huán)境中配置反應(yīng)體系，防止空氣中的污染源。
5. PCR 擴(kuò)增的水要經(jīng)過高壓滅菌或 0.2um 濾膜過濾。
6. 產(chǎn)物切膠回收二次擴(kuò)增前，要先鑒定，二次擴(kuò)增模板稀釋 1000 倍。
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